(предусматривают определение общей микробной обсеменённости (ОМЧ), определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов).

Санитарно состояние почвы – совокупность физико-химических, биологических свойств почвы, определяющих качество и степень её безопасности в эпидемическом и гигиеническом отношении. Состав микрофлоры почвы меняется в зависимости от её глубины. В поверхностном слое почвы (0 – 10 см) количество микроорганизмов незначительно; это связано с губительным действием прямого солнечного света и низкой влажностью почвы. Максимальное количество микроорганизмов обнаруживается на глубине 10 - 30 см. На глубине 1 м выявляются единичные клетки бактерий. Наиболее богата микроорганизмами культурная возделываемая почва (до 5 млрд. клеток на 1 г почвы), наимеее - почва, бедная влагой и органическими веществами (200 млн. клеток в 1 г). Оценка санитарного состояния почвы проводится по санитарно-бактериологическим показателям, которые делятся на косвенные и прямые.

Косвенные показатели характеризуют интенсивность биологической нагрузки на почву. Это санитарно-показательные микроорганизмы: бактерии группы кишечной палочки (общие колиформные бактерии) и энтерококки. В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика и, как следствие, высоки индексы санитарно-показательных микроорганизмов, что наряду с санитарно-химическими показателями свидетельствует о неблагополучии и создании повышенного риска инфицирования. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрификаторов, термофилов, а также относительно высокое содержание вегетативных форм Clostridium perfringens. Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели.

Прямые санитарно-бактериологические показатели эпидемической опасности почвы – обнаружение возбудителей кишечных инфекций (патогеннные энтеробактерии, энтеровирусы). Результаты анализов оцениваются в соответствии с таблицей «Оценка степени эпидемической опасности почвы».

Оценка степени эпидемической опасности почвы

При необходимости углубленной оценки санитарного состояния почвы и способности её к самоочищению исследуют показатели биологической активности почвы. Основными интегральными показателями биологической активности почвы являются: общая микробная численность (ОМЧ), клостридии, термофильные бактерии, грибы, актиномицеты, аммонификаторы.

Для определения ОМЧ почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 . Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45 0 С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний.

Санитарно-микробиологическое состояние питьевой воды оценивается по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству мезофильных факультативно-анаэробных микроорганизмов (МЕФАМ) в 1 мл воды; присутствию общих и термотолерантных колиформных бактерий.

По эпидемиологическим показаниям, в воде дополнительно определяют наличие энтерококков, сальмонелл, шигелл, вибрионов, энтеровирусов.

Определение общего числа микроорганизмов

Общее микробное число (ОМЧ) - общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при t=37 0 в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Из каждой пробы воды делают посев не менее двух объёмов по 1 мл. Для этого 1 мл воды вносят в стерильную чашку Петри, заливают 6-8 мл расплавленного и остуженного до 45-46 0 С питательного агара, тщательно перемешивают. После застывания агара чашки помещают вверх дном и инкубируют при 37 0 С в течение 24 часов. Затем подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Подсчитанное количество колоний на каждой чашке суммируют и делят на 2. Результат выражают в КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл исследованной пробы воды.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные, не образующие споры палочки, не обладающие оксидазной активностью ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при 37 0 С в течение 24 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, но, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при 44 0 С в течение 24 часов.

Питьевой воды

(согласно СанПиНу 2.1.4.559–96)

Примечания: 1 – при определении проводится 2-кратное исследование по 100 мл отобранной пробы воды; 2 – превышение норматива не допускается в 95% проб, отбираемых в точках водоразбора наружной и внутренней водопроводной сети в течение 12 месяцев, при количестве исследуемых проб не менее 100 за год; 3 – определение проводится только в системах водоснабжения из поверхностных источников перед подачей воды в распределительную сеть; 4 – определение проводится только при оценке эффективности технологии обработки воды.

Метод мембранных фильтров

Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объёме 333 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 0 С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Для этого фильтр с выросшими на нём колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-n-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37 0 С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре.

Бродильный метод

Засевают 3 объёма воды по 100 мл (для качественного анализа) или при исследовании воды с целью количественного определения общих колиформных бактерий делают посев 3 объёмов по 100 мл, 3 – по 10 мл и 3 – по 1 мл.

Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл воды – в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при 37 0 С в течение 24-48 часов. Через 24 часа из питательной среды, где отмечено наличие роста и образование газа , делают высев по секторам на среду Эндо, приготовленную с добавлением фуксина.

Положительный результат на присутствие общих колиформных бактерий в данном объёме воды дают по помутнению и образованию газа на среде накопления (глюкозо-пептонная среда или лактозо-пептонная среда) и наличию красных колоний на среде Эндо. В сомнительных случаях выполняют оксидазный тест и подтверждают способность к газообразованию на среде с лактозой или маннитом (глюкозой).

Результат отрицательный , если

– в среде накопления нет признаков роста,

– на секторах среды Эндо нет роста лактозоположительных колоний,

– на секторах среды Эндо выросли нехарактерные для колиформных бактерий колонии,

– все колонии оказались оксидазоположительными,

– если в подтверждающем тесте на среде с лактозой или маннитом (глюкозой) не отмечено газообразования.

Наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий (общих и термотолерантных колиформных бактерий) – вычисляют по специальным таблицам.

Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству особей, обнаруживаемых в 1 м 3 воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий: гемолитических стрептококков, золотистых стафилококков, а также дрожжевых и плесневых грибов.

Согласно СанПиН 2.1.3.1375-03, воздушная среда помещений лечебных учреждений и аптек по уровню бактериальной обсеменённости разделена на 4 класса.

Микробиологические показатели для оценки воздушной среды аптечных учреждений можно определить путём посева воздуха седиментационным (по Коху) или аспирационным методом (в аппарате Кротова).

Допустимые уровни бактериальной обсеменённости воздушной среды помещений лечебных учреждений в зависимости от их
функционального назначения и класса чистоты

Класс чистоты	Название помещений	Санитарно-микробиологические показатели
общее количество микроорганизмов в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество колоний S.aureus в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 дм 3 воздуха
до начала	во время работы	до начала	во время работы	до начала	во время работы
Особо чистые (А)	Операционные, родильный зал, асептические боксы для гематологических, ожоговых больных, палата для недоношенных, асептический блок аптек, стерилизационные (чистая половина) боксы бактериологических лабораторий	не более 200	не более 500	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Чистые (Б)	Процедурные, перевязочные, предоперационные, палаты реанимации, залы реанимации, детские палаты, комнаты сбора и пастеризации грудного молока, ассистентские и фасовочные аптек, дистилляторная, помещения бактериологических и клинических лабораторий, предназначенные для исследований	не более 500	не более 750	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Условно чистые (В)	Палаты хирургических отделений; коридоры, примыкающие к операционным и родильным залам; смотровые, боксы и палаты инфекционных отделений, ординаторские, материальные, кладовые чистого белья	не более 750	не более 1000	не должно быть	не более 2	не должно быть	не должно быть
Грязные (Г)	Коридоры и помещения административных зданий, лестницы, лечебно-диагностические, санитарные комнаты, туалеты, комнаты грязного белья	Не нормируются

Седиментационный метод (по Коху) – оседание микробов под действием силы тяжести - является простым способом изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определённое время (5-10 минут на общую обсеменённость и не менее 40 минут на кокковую микрофлору), затем их закрывают, маркируют и выдерживают 24 часа в термостате и 24 часа при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязнённости воздуха: по приблизительному подсчёту на площадь 100 см 2 в течение 5 минут оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Аспирационный метод – более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов. Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью.

После инкубации посева в термостате проводят расчёт микробного числа по формуле:

ОМЧ	=	N х 1000
V

где N – количество выросших на чашке колоний;

V – объём пропущенного через прибор воздуха, дм 3 ;

1000 - искомый объём воздуха, дм 3 .

Наличие санитарно-показательных для воздуха микроорганизмов – золотистого стафилококка, гемолитического стрептококка, плесневых грибов, кандид – определяют по характеру выросших колоний на специальных средах (желточно-солевом агаре, кровяном агаре, среде Сабуро) и при микроскопическом изучении бактерий из этих колоний.

Контрольные вопросы

Каковы особенности ферментных систем бактерий? Как регулируется продукция ферментов у бактерий? Какие группы ферментов различают в зависимости от механизма, которым регулируется продукция фермента? Какое практическое значение имеет изучение ферментативной активности бактерий? Методы изучения сахаролитической и протеолитической активности бактерий. Дифференциально-диагностические среды: перечислите, назовите основные составные части и применение. На какое изменение среды реагирует индикатор в этих средах? По какому признаку дифференцируются бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева? Каким свойством должны обладать бактерии, чтобы образовать на этих средах окрашенные колонии? Если бактерии образуют бесцветные колонии, что это означает? Среды Гисса их состав и применение. Что такое «пёстрый» или «цветной» ряд? Среда Олькеницкого, её состав; как производится посев и как отмечают на этой среде ферментацию разных углеводов, образование сероводорода? Что представляют собой микротест-системы для определения ферментативной активности микробов; как производят посев и как учитывают результаты? Что такое СИБ; как используется эта система, как производится посев и учёт результатов? Укажите основные объекты внешней среды, которые подвергаются санитарно-бактериологическому исследованию. Микробиоценоз, определение понятия. Перечислите и дайте характеристику межвидовых взаимоотношений в микробиоценозах. Какие показатели определяются при бактериологической оценке объектов внешней среды? Санитарно-показательные микроорганизмы: определение понятия. Какими свойствами должны обладать санитарно-показательные микроорганизмы? Перечислите санитарно-показательные микроорганизмы для воздуха, воды, почвы. Микрофлора воды: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воды. Методика определения общего микробного числа воды. Показатели фекального загрязнения воды, методы их определения. Укажите предельно допустимые показатели для питьевой воды. Микрофлора воздуха: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воздуха, методы их определения. Микрофлора почвы: постоянная микрофлора, её значение для круговорота веществ в природе. Источники загрязнения почвы патогенными микроорганизмами. Показатели для санитарно-бактериологической оценки. Для каких заболеваний факторами передачи могут быть вода, воздух, почва? Некультивируемые формы бактерий: определение понятия, практическое значение.

Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бакте-
рий – показателей фекального загрязнения. Почвы с преобладанием санитарно-показательных бактерий расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязнённые фекалиями человека или животных. Присутствие в почве E. coli и Enterococcus faecalis указывает на свежее (до 2 недель), бактерий родов Citrobacter и Enterobacter – на несвежее (до 2 месяцев), а Clostridium perfringens – на давнее (более 2 месяцев) фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса – количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титра – масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общего числа сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.

Микробиологические нормативы для оценки санитарного состояния почвы:

– чистая почва: коли-титр – 1 и выше; перфрингенс-титр – 0,01 и выше; ОМЧ – 100-1000;

– загрязнённая почва: коли-титр – 0,9-0,01; перфрингенс-титр – 0,009-0,0001; ОМЧ – 1000-100000;

– сильно загрязнённая почва: коли-титр – 0,009 и ниже; перфрингенс-титр – 0,00009 и ниже; ОМЧ – 10000-4000000.

Для определения коли-титра, перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера. Инкубируют при 43 0 С 48 часов. При получении в средах газообразования и помутнения производят высев петлей на среду Эндо. Отбирают типичные для кишечной палочки колонии, делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба отрицательная, проверяют ферментативные свойства выделенной культуры посевом на полужидкую среду с глюкозой. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие E. coli. Определяют коли-титр по наименьшему объёму, в котором обнаруживают БГКП.

Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают в пробирки со стерильной железосульфитной средой Вильсон-Блера. После 48 часов инкубации при 43 0 С учитывают результаты по образованию черных колоний C. perfringens в агаровом столбике среды. Мазки окрашивают по Граму, микроскопируют (крупные грамположительные палочки со спорами овальной формы, центрального или субтерминального расположения), вычисляют перфрингенс-титр (наибольшее разведение посевного материала, посев которого приводит к почернению и разрыву среды в первые 12 часов роста при 43 0 С).

Определение общего числа микроорганизмов

Общее микробное число (ОМЧ) - общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при t=37 0 С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

(согласно СанПиНу 2.1.4.559–96)

Метод мембранных фильтров

Бродильный метод

Посевы инкубируют при 37 0 C в течение 24-48 часов. Через 24 часа из питательной среды, где отмечено наличие роста и образование газа , делают высев по секторам на среду Эндо, приготовленную с добавлением фуксина.

Результат отрицательный , если

– в среде накопления нет признаков роста,

– на секторах среды Эндо нет роста лактозоположительных колоний,

– на секторах среды Эндо выросли нехарактерные для колиформных бактерий колонии,

– все колонии оказались оксидазоположительными,

– если в подтверждающем тесте на среде с лактозой или маннитом (глюкозой) не отмечено газообразования.

Согласно СанПиН 2.1.3.1375-03, воздушная среда помещений лечебных учреждений и аптек по уровню бактериальной обсемененности разделена на 4 класса.

Микробиологические показатели для оценки воздушной среды аптечных учреждений можно определить путем посева воздуха седиментационным (по Коху) или аспирационным методом (в аппарате Кротова).

Класс чистоты	Название помещений	Санитарно-микробиологические показатели
общее количество микроорганизмов в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество колоний S.aureus в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 дм 3 воздуха
До начала	Во время работы	До начала	Во время работы	До начала	Во время работы
Особо чистые (А)	Операционные, родильный зал, асептические боксы для гематологических, ожоговых больных, палата для недоношенных, асептический блок аптек, стерилизационные (чистая половина) боксы бактериологических лабораторий	не более 200	не более 500	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Чистые (Б)	Процедурные, перевязочные, предоперационные, палаты реанимации, залы реанимации, детские палаты, комнаты сбора и пастеризации грудного молока, ассистентские и фасовочные аптек, дистилляторная, помещения бактериологических и клинических лабораторий, предназначенные для исследований	не более 500	не более 750	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Условно чистые (В)	Палаты хирургических отделений; коридоры, примыкающие к операционным и родильным залам; смотровые, боксы и палаты инфекционных отделений, ординаторские, материальные, кладовые чистого белья	не более 750	не более 1000	не должно быть	не более 2	не должно быть	не должно быть
Грязные (Г)	Коридоры и помещения административных зданий, лестницы, лечебно-диагностические, санитарные комнаты, туалеты, комнаты грязного белья	Не нормируются

После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:

ОМЧ	=	N ∙ 1000
V

где N – количество выросших на чашке колоний;

V – объём пропущенного через прибор воздуха, дм 3 ;

1000 - искомый объём воздуха, дм 3 .

Контрольные вопросы

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Выпишите названия (по-латыни) видов санитарно-показательных микроорганизмов для воды, воздуха и почвы.

Самостоятельная работа студента на практическом занятии

1. Выделение чистой культуры бактерий–аэробов (3-й день). Изучите культуру на скошенном агаре макроскопически, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте, сделайте вывод о чистоте культуры. Для дальнейшей идентификации выделенной культуры произведите посев на среды «пёстрого» ряда и на среду Олькеницкого. Изучите готовые посевы аэробных бактерий на средах «пёстрого» ряда и на среде Олькеницкого, составьте таблицу «Биохимическая активность микроорганизмов». Ознакомьтесь с методикой изучения ферментативной активности бактерий с помощью микротест-систем и СИБ.

2. Выделение чистой культуры анаэробов (4–й день). Изучите характер роста культуры на среде Китта–Тароцци, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте.

3. Исследование микрофлоры воды и воздуха. Произведите посев водопроводной воды для определения общего микробного числа (ОМЧ). Определите показатели фекального загрязнения воды (наличие колиформных бактерий) по демонстрационным посевам и по таблице. Произведите посев воздуха лаборатории седиментационным методом и с помощью аппарата Кротова.

4. Методы изучения нормальной микрофлоры организма человека (подготовка к следующему занятию). Возьмите стерильным тампоном слизь из зева друг у друга и сделайте посев в пробирку с сахарным мясо-пептонным бульоном. Сделайте посев с кожи рук на чашку с МПА: возьмите маленький стерильный ватный тампон, смочите его в стерильном физиологическом растворе, протрите кожу, сделайте посев этим тампоном.

Принципы, которыми руководствуются микробиологи при санитарно-микробиологических исследованиях, исходят из основной задачи, разрешаемой ими: определение возможности присутствия в исследуемом объекте патогенных микроорганизмов или токсинов, образующихся при их жизнедеятельности, а также обнаружение и оценка степени порчи пищевых продуктов.

Первым принципом является правильное взятие проб для санитарно-микробиологических исследований с соблюдением всех необходимых условий, регламентированных для каждого исследуемого объекта, и правил стерильности. Ошибки, допущенные при взятии проб, приводят к получению неправильных результатов, и исправить их уже нельзя. При упаковке и транспортировке проб необходимо создавать такие условия, чтобы не допустить гибели или размножения исходной микрофлоры в исследуемом объекте, что может исказить результаты исследований. Поэтому одним из правил является, возможно, быстрое проведение исследований, и, если необходимо, сохранение материала только в условиях холодильника и не более 6-8 часов. Каждая проба сопровождается документом, в котором указывают название исследуемого материала, номер пробы, время, место взятия, характеристика объекта, подпись лица, взявшего пробу.

Второй принцип – проведение серийных анализов исходит из особенностей исследуемых объектов. Как правило, вода, почва, воздух и другие объекты содержат разнообразные микроорганизмы, распределение которых неравномерно. К тому же микроорганизмы, находясь в биоценотических отношениях, подвергаются взаимному влиянию, что ведет к гибели одних и активному размножению других. Поэтому берут серию проб из разных участков исследуемого объекта, по возможности большее количество проб, что позволит получить более достоверную характеристику объекта. Доставленные в лабораторию пробы смешивают, затем точно отмеряют необходимое количество материала – среднее по отношению к исследуемому материалу в целом.

Третий принцип – повторное взятие проб – необходимо для получения сопоставимых результатов. Это связано, прежде всего, с тем, что исследуемые объекты весьма динамичны (вода, воздух и т.п.), сменяемость микрофлоры в них во времени и пространстве очень велика. Патогенные микроорганизмы попадают в окружающую среду, как правило, в небольшом количестве, да и распределяются в ней равномерно. Поэтому повторное взятие проб позволяет более точно определить биологическую контаминацию объектов окружающей среды.

Четвертый принцип – применение стандартных и унифицированных методов, утвержденных соответствующими ГОСТами и инструкциями, что дает возможность получить сравнимые результаты.

Пятый принцип – использование при оценке исследуемых объектов одновременно комплекса тестов для получения разносторонней санитарно-микробиологической характеристики. Применяют прямой метод обнаружения патогенных микроорганизмов и косвенный - позволяющий судить о загрязнении объектов окружающей среды выделениями человека и животных и его степени. К косвенным тестам относится определение общего микробного числа, количественного и качественного состава санитарно-показательных микроорганизмов. Применение косвенных методов оценки потенциальной возможности загрязнения объектов окружающей среды патогенными микроорганизмами, использование как бы обходного пути для изучения обсемененности материалов, является особенностью санитарно-микробиологических исследований.

Шестой принцип – заключается в проведении оценки исследуемых объектов по совокупности полученных результатов при использовании санитарно-микробиологических тестов других гигиенических показателей, указанных в соответствующих ГОСТах и нормативах (органолептических, химических, физических и т.д.). Всегда необходимо учитывать, что развитие микробов тесно связано с другими факторами окружающей среды, которые могут оказывать как благоприятное, так и неблагоприятное влияние, усиливая или ограничивая возможности размножения патогенных микроорганизмов и накопления их токсинов. Следует учитывать и то, что почти любой объект исследования имеет собственную микрофлору, которая вызывает специфические биохимические процессы, и те изменения в объектах, которые обусловливаются посторонними микроорганизмами. Санитарный микробиолог должен хорошо знать ход биохимических процессов, происходящих в норме и в исследуемом объекте (сырье, пищевые продукты, готовом изделии и т.д.), технологию производства, уметь определить характер вредного воздействия попавших микробов, возможные последствия такого воздействия и рекомендовать конкретные мероприятия по их предупреждению. Нередко врачу приходится прибегать к помощи специалистов в области общей, сельскохозяйственной, промышленной, ветеринарной микробиологии и решать вопрос при непосредственном участии соответствующих специалистов.

Седьмой принцип – ответственность врачей санитарной службы за точность обоснования выводов и заключений о состоянии исследуемых объектов. При санитарно-микробиологическом исследовании выявляется степень порчи пищевых продуктов (или других объектов), пригодность их к употреблению, возможная опасность для здоровья населения. Если пищевые продукты возможно реализовать, врач должен дать обоснованную рекомендацию о наиболее рациональном способе их обработки и употреблении. Запрещается использовать пищевые продукты, воду водоемов и др. Закрытие предприятия из-за санитарного неблагополучия наносит определенный экономический ущерб. Ответственность за такое решение несет врач санитарной службы. Для большей объективности в оценке полученных результатов и заключениях врачи пользуются специальными инструкциями, нормативами, ГОСТами, разработанными профильными санитарно-микробиологическими учреждениями и утвержденными Министерством Здравоохранения. Эти стандарты периодически пересматриваются и приводятся в соответствие с изменениями, которые вытекают из практического опыта, материальных возможностей, современного уровня знаний и развития техники.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования

«ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» (ПГУ)

Основы санитарной микробиологии

Учебно-методическое пособие для студентов медицинских вузов

Методическое пособие подготовлено на кафедре микробиологии, эпидемиологии и инфекционных болезней медицинского института ПГУ.

Пособие составлено в соответствии с программой по микробиологии, вирусологии для студентов медицинских вузов.

Изложены задачи и методы санитарной микробиологии. Приведены методы санитарно-микробиологического обследования объектов, актуальных в плане возникновения и распространения инфекций

Список сокращений. 4

1. Задачи санитарной микробиологии. 5

2. Методы санитарной микробиологии. 6

2.1. Понятие о санитарно-показательных микроорганизмах. 7

2.2. Характеристика основных групп СПМ.. 9

2.3. Косвенные показатели загрязнения. 11

3. Принципы санитарно-микробиологических исследований. 14

4. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха. 16

4.1. Микрофлора воздуха. 16

4.2. Исследование воздуха. 18

5. Санитарно-микробиологическое исследование воды. 27

5.1. Микрофлора воды. 27

5.2. Исследование воды.. 28

6. Санитарно-микробиологическое исследование почвы. 52

6.1. Микрофлора почвы. 52

6.2. Исследование почвы. 54

7. Санитарный режим лечебно-профилактических учреждений. 60

7.1. Организация дезинфекционных и стерилизационных мероприятий в лечебно-профилактических организациях (ЛПО). 62

7.2. Санитарно-микробиологическое исследование оборудования, рук и спецодежды персонала. 85

7.3. Санитарно-бактериологическое исследование перевязочного, шовного и другого хирургического материала. 87

7.4. Исследование на носительство золотистого стафилококка. 88

8. Санитарно-микробиологическое исследование пищевых продуктов. 89

8.1. Микрофлора пищевых продуктов. 89

8.2. Исследование пищевых продуктов. 90

8.3. Санитарно микробиологическое исследование молока и молочных продуктов 96

Список литературы. 103

Список сокращений

СПМ - санитарно-показательные микроорганизмы

БГКП - бактерии группы кишечной палочки

ВБИ - внутрибольничные инфекции

КМАФАМ – количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

КОЕ - колониеобразующие единицы

ЛПО – лечебно-профилактические организации

ЛПУ – лечебно-профилактические учреждения

ЛКП - лактозоположительные кишечные палочки

ОМЧ – общее микробное число

МАФАМ или МАФАнМ – мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы

МПА – мясо-пептонный агар

ОЧС – общее число сапрофитов

ТКБ - термотолерантные колиформные бактерии

1. Задачи санитарной микробиологии.

Санитарная микробиология – медико-биологическая наука, исследующая закономерности существования потенциально опасных для человека микроорганизмов в окружающей среде и обусловливаемые ими процессы, которые могут непосредственно или косвенно оказывать вредное влияние на здоровье людей.

Санитарная микробиология относится к группе профилактических наук и находится на стыке микробиологии, гигиены и эпидемиологии.

Объектами изучения санитарной микробиологии являются:

· потенциально патогенные и санитарно-показательные микроорганизмы внешней среды,

· физические, химические и биологические факторы внешней среды, способствующие или препятствующие существованию этих групп микроорганизмов во внешней среде и их проникновению в организм человека.

Важнейшими задачами санитарной микробиологии являются:

1) изучение закономерностей взаимообмена (круговорота) потенциально опасных для человека микробов между микропопуляциями людей, животных и совокупностью объектов окружающей среды, включая условия существования микробов в этих трех средах;

2) поиск и использование микробиологических методов оценки безопасности для человека пищевых продуктов, воды, воздуха и разнообразных предметов и материалов;

3) разработка нормативов, устанавливающих соответствие качественного и количественного состава микрофлоры конкретных объектов внешней среды гигиеническим требованиям;

4) оценка путей воздействия человека и животных на окружающую среду. В результате промышленной и индивидуальной деятельности людей происходит контаминация объектов окружающей среды патогенными микроорганизмами, при этом особое внимание уделяется изучению нарушений процессов самоочищения воды, почвы;

2. Методы санитарной микробиологии

Методы, используемые в санитарной микробиологии, можно разделить на 2 группы: прямые и косвенные.

Прямые методы предполагают непосредственное обнаружение возбудителей инфекционных болезней или их токсинов в объектах окружающей среды.

Для определения патогенных микроорганизмов могут быть использованы следующие методы:

Прямой посев исследуемого материала на питательные среды;

Предварительная концентрация патогенных микроорганизмов пропусканием исследуемого объекта (жидкой консистенции) через мембранные фильтры или посевом в среды накопления;

Обнаружение патогенных микроорганизмов методом заражения чувствительных животных (биопроба);

Применение ускоренных методов: серологических, иммунолюминисцентного и радиоиммунного анализов.

Методы прямого обнаружения - наиболее точные и надёжные критерии оценки эпидемиологической опасности внешней среды. Несмотря на то, что в настоящее время разработаны методы прямого, ускоренного и количественного определения потенциально патогенных микробов, данный метод имеет целый ряд недостатков. К ним относятся следующие:

· патогенные микроорганизмы находятся в окружающей среде непостоянно - сравнительно легко их можно обнаружить в период эпидемии той или иной инфекции, но очень трудно - в межэпидемические периоды. Основная же деятельность санитарных микробиологов направлена на предупреждение возникновения эпидемий и поэтому вся работа ведется в межэпидемические периоды;

· концентрация патогенных микроорганизмов в окружающей среде значительно уступает непатогенным и распространение их в объектах неравномерно;

· при выделении патогенных микроорганизмов методами культивирования на питательные среды, даже ингибиторные, они неизбежно страдают от конкуренции сапрофитной флоры.

В связи с вышеизложенным получаемые отрицательные результаты прямого определения патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды еще не говорят с достоверностью об их отсутствии.

Косвенные методы предполагают определение общего числа микробов и обнаружение санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ).

2.1. Понятие о санитарно-показательных микроорганизмах

Микроорганизмы, обитающие в кишечнике или в верхнем отделе дыхательных путей человека и животных и постоянно выделяющиеся окружающую среду, называются санитарно - показательными .

По количеству СПМ можно косвенно судить о возможном присутствии патогенов во внешней среде. То есть при их определении исходят из предположения, что чем больше объект загрязнен выделениями человека и животных, тем больше будет СПМ и тем вероятнее присутствие патогенов.

Основные требования, предъявляемые к санитарно-показательным микроорганизмам, следующие:

1) постоянное обитание в естественных полостях организма человека и животных (которые являются их единственной природной средой обитания - биотопом) и выделение их в большом количестве в окружающую среду;

2) продолжительность выживания их в окружающей среде должна быть такой же или большей, чем патогенных микроорганизмов, выводимых из организма теми же путями;

3) не должны размножаться в окружающей среде;

4) не должны сколько-нибудь значительно изменять свои биологические свойства при попадании в окружающую среду;

5) должны быть достаточно типичными, с тем, чтобы их дифференциальная диагностика осуществлялась без особого труда;

6) индикация, идентификация и количественный учет должны производиться современными, простыми, легко доступными и экономичными микробиологическими методами.

Все санитарно-показательные микроорганизмы являются индикаторами биологического загрязнения. Выделяют несколько групп микроорганизмов, обнаружение которых в объектах окружающей среды говорит о различных видах загрязнения. Но между группами СПМ нет четких границ, так как некоторые микроорганизмы являются показателями различных видов загрязнения.

Принципы, которыми руководствуются при санитарно-микробиологических исследованиях, исходят из основной задачи, разрешаемой ими: определение возможности присутствия в исследуемом объекте патогенных микроорганизмов или токсинов, образующихся в результате жизнедеятельности; обнаружение и оценка степени порчи изучаемого объекта (особенно пищевых продуктов).

Второй принцип - проведение серийных анализов. Серию проб берут из разных участков исследуемого объекта, что позволит получить более достоверную характеристику объекта. Доставленные в лабораторию пробы смешивают, затем точно отмеряют необходимое количество материала - среднее по отношению к исследуемому материалу в целом.

Третий принцип - повторное взятие проб (получение сопоставимых результатов).

Четвертый принцип - применение стандартных и унифицированных методов исследования, утвержденных соответствующими ГОСТами и инструкциями. Это позволяет в различных лабораториях получать сравнимые результаты.

Пятый принцип - одновременное использование комплекса тестов при оценке исследуемых объектов для получения разносторонней санитарно-микробиологической характеристики.

Шестой принцип - проведении оценки исследуемых объектов по совокупности полученных результатов, полученных при использовании санитарно-микробиологических тестов с учетом других гигиенических показателей, указанных в соответствующих ГОСТах и нормативах (органолептических, химических, физических и т. д.).

Седьмой принцип - ответственность сотрудников санитарной службы за точность обоснования выводов и заключений о состоянии исследуемых объектов.

Для большей объективности оценки получаемых результатов врачи пользуются специальными инструкциями, нормативами, ГОСТами, разработанными профильными санитарно-микробиологическими учреждениями и утвержденными Министерством здравоохранения и социального развития РФ. Эти стандарты периодически пересматриваются и приводятся в соответствие с изменениями, которые вытекают из практического опыта, материальных возможностей, современного уровня знаний и развития техники.

Методы санитарно-микробиологических исследований

Санитарная микробиология при индикации и идентификации санитарно-показательных, патогенных микроорганизмов, при определении общей микробной обсемененности объектов окружающей среды использует методы, которые применяются в диагностических микробиологических лабораториях:

- микроскопической (при индикации и прямом подсчете микроорганизмов в исследуемом объекте);
- бактериологический - выделение микроорганизмов и их идентификация;
- биологический - заражение чувствительных животных;
- ускоренные (инструментальные) методы (реакция иммунофлюоресценции, радиоизотопный метод и др.).

Комплекс тестов, используемых для разносторонней и полноценной санитарно-микробиологической характеристики объектов окружающей среды:

- определение количества аэробных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ);
- определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов;
- индикация в исследуемых объектах патогенных микроорганизмов и их токсинов;
- определение степени микробной порчи изучаемых объектов или продуктов.

Существует два метода определения КМАФАнМ:

- метод прямого подсчета (в счетных камерах Горяева или в камерах, для счета бактерий, на мембранных фильтрах, через которые пропускают исследуемую жидкость или взвесь);
- метод количественного посева различных разведений образцов и проб исследуемого объекта на плотные питательные.

Выявляются лишь мезофильные, аэробные или факультативно-анаэробные бактерии.

Оба метода являются относительными, приблизительными. Для получения сравнимых результатов определение общего микробного числа исследуемых объектов проводится по стандартным, конкретным для каждого случая методикам, регламентированным соответствующими ГОСТами.